故事背景设定在抗日战争时期。军统谍报网接连遭到日特破坏，军统局局长戴笠（王岗 饰）为予以还击，特从息烽集中营选出了因故入狱的原国民革命军少校陈一鸣（庹宗华 饰），令其组建一支代号“眼镜蛇”的特工突击小组，誓要对日特头子中村一郎（于震 饰）展开暗杀，以血还血。领命后的陈一鸣迅速行动，招募了各路身怀绝技的高人，并带领他们通过了严酷的特训。恰在此时，中村一郎逮捕了美国海军情报署的特工史密斯夫妇。美军上校梅乐斯找到戴笠，请求设法营救。与此同时，中共高级特工黄天明（侯勇 饰）收到了来自南京联络站站长黄云晴（吴晓敏 饰）的情报。黄云晴通过潜伏于日军内部的内线，成功获取了史密斯夫妇所在医院的地图与戒备情况。黄天明奉上级指示，出于抗日民族统一战线的考量，将该情报故意泄露给军统南京站高站长。陈一鸣随即带领特工小组空降渗透至南京。他们化装成日本劳军演出队混入医院，在日特的眼皮底下成功救出史密斯夫妇，并将医院炸成一片火海。然而，就在小组成员们准备返程之际，陈一鸣却表示本次行动还有一项更为艰巨的首要任务——刺杀中村一郎。面对中村一郎布下的天罗地网与全城戒严，他们能顺利完成任务吗……